Vol 2 No 3 2017 – 5

 INVESTIGATION / RESEARCH

Evaluación de la incidencia del Virus de la marchitez moteada del tomate (TSWV) en arvenses asociadas al cultivo de crisantemo en el Valle de San Nicolás

Incidence of Tomato spotted wilt virus (TSWV) in associated weeds to chrysanthemum crops in San Nicolas Valley, Antioquia
Elizabeth Castro1, Mario Quijano2, Nubia Velásquez3
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2017.02.03.5
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RESUMEN
Para la región del Oriente antioqueño el cultivo de crisantemo es una importante fuente de empleo y motor de desarrollo, una limitante de la producción de este cultivo es la enfermedad causada por TSWV. En un programa de manejo integrado de enfermedades se busca identificar y detener la entrada y dispersión del patógeno dentro del cultivo; en el caso del patosistema TSWV-Crisantemo, una puerta de entrada importante pueden ser las arvenses aledañas a los bloques de producción, ya que permiten la propagación del vector (trips) y sirven de reservorio para la enfermedad. Es por esto que este trabajo tuvo como objetivos: identificar las especies de arvenses adyacentes a los cultivos de crisantemo del Oriente antioqueño, evaluar la incidencia de TSWV en ellas y determinar las especies de trips presentes en las arvenses más frecuentemente encontradas. Se colectaron 360 plantas en 6 fincas productoras de Crisantemo de la región, se clasificaron taxonómicamente y se encontraron 34 especies dentro de 19 familias botánicas de las cuales las especies encontradas con mayor frecuencia fueron: Galinsoga quadriradiata, Cardamine hirsuta, Oxalis latifolia, Amaranthus viridis, Senecio vulgaris y Polygonum nepalense. Se realizó prueba DAS-ELISA para la detección de TSWV a las 34 especies  y se encontró que solo una arvense fue positiva, Portulaca oleracea; en un muestreo posterior se evaluaron otras 20 plantas por RT-PCR de las más frecuentes que se encontraron y en este segundo grupo no fue detectada ninguna planta infectada por TSWV. Los trips encontrados en las especies de arvenses evaluadas pertenecen al género Frankliniella sp., especies: F. occidentallis y F. panamensis. En este trabajo se observó una mayor captura de insectos en crisantemo que en las arvenses acompañantes, lo que sugiere su mayor preferencia por el cultivo y explicaría la baja transmisión de TSWV observada en las plantas arvenses.
Palabras clave: crisantemo, TSWV, trips, arvenses
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ABSTRACT
Chrysanthemum crops for the Eastern region of Antioquia are an important source of employment and a development engine. The production of this crop is limited by the disease caused by TSWV. An integrated disease management program is aimed to identify and stop the entry and spread of the pathogen within the crop, in TSWV-chrysanthemum pathosystem, an important gateway could be open by weeds surrounding greenhouses that allow vector (thrips) spreading and serve as a reservoir for the disease. Therefore, this research aimed to: identify the species of weeds located adjacent to chrysanthemum crops in eastern Antioquia, evaluate the incidence of TSWV in them and determine the species of thrips present in most frequently found weeds.
A sample of 360 plants was collected in six farms of chrysanthemum and was taxonomically classified. A total of 34 species in 19 plant families were found, of which, Galinsoga quadriradiata, Cardamine hirsuta, Oxalis latifolia, Amaranthus viridis, Senecio vulgaris and Polygonum nepalense occur more frequently. A DAS- ELISA test was performed to detect TSWV in every weed species, resulting that only one Portulaca oleracea plant was positive. In a subsequent sampling, 20 other plants were tested by RT-PCR but none TSWV infected plant was detected. All thrips found in the evaluated weeds belonged to the genus Frankliniella sp., species: F. occidentallis and F. panamensis. In this work, a greater capture of insects was observed on chrysanthemum than weeds, suggesting their stronger preference for this crop and explaining their low TSWV transmission into the weed plants.
Key words: chrysanthemum, TSWV, thrips, weeds
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INTRODUCCIÓN
La producción de flores de corte ocupa el segundo renglón de la economía no tradicional y el séptimo lugar del total de la participación de las exportaciones de Colombia8. Dentro de este renglón, el crisantemo representa el 8% de la producción, siendo la región del Oriente Antioqueño la que alberga la mayor parte de esta producción en el país (43%) y genera también la mayor fuente de empleo del sector, con más de dos mil empleos directos2. En los últimos años, se ha visto reducida la producción de crisantemo en la región a causa de la alta incidencia de la enfermedad causada por Tomato spotted wilt virus  (TSWV), que ocasiona deformación con lesiones necróticas en los tallos, y en las hojas, clorosis en V y/o anillos necróticos o cloróticos 19.
TSWV tiene un rango de hospederos muy amplio, incluyendo aproximadamente mil especies distribuidas en 90 familias botánicas entre las que se incluyen varios cultivos de importancia comercial y plantas silvestres, principalmente de las familias AsteraceaeSolanaceae y Fabaceae 5,18. La manifestación de los síntomas ocasionados por TSWV en diferentes hospederos ha sido reportada como altamente dependiente de la especie vegetal, de las condiciones ambientales, del estado nutricional de la planta y de la edad al momento de la infección, así que es posible encontrar infecciones asintomáticas en varios hospederos 12. Los síntomas comunes observados en algunas arvenses infectadas por TSWV son: clorosis generalizada, moteados en hojas, deformación de tallos, flores y hojas, enanismo y manchas concéntricas cloróticas o necróticas en las hojas 6, 10, 11.
TSWV es transmitido de un modo persistente-propagativo por 11 especies de trips; entre los más importantes se encuentran Frankliniella occidentallis y Thrips palmi siendo el primero el vector con mayor eficiencia de transmisión y altamente polífago, ya que parasita aproximadamente 200 especies de plantas13. Sólo las larvas de trips tienen la capacidad de adquirir partículas de TSWV durante su alimentación, luego el virus se replica al interior del insecto y se instala en las glándulas salivares para poder ser transmitido por el estado adulto cuando este se alimenta de una nueva planta, permaneciendo infectivo por el resto de su vida 13,17.
Dado que muchas plantas arvenses asociadas al cultivo de crisantemo son hospedero tanto de trips como de TSWV, pueden constituir un reservorio permanente 18 y ser la principal puerta de entrada a la enfermedad en un cultivo, como se ha demostrado que ocurre en cultivos de lechuga, tomate y pimentón 9, 20. Por estas razones este trabajo fue desarrollado para identificar las especies arvenses presentes en cultivos de crisantemo, determinar la incidencia de TSWV en ellas e identificar las que sirven como hospedero de los vectores de la enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de muestras e identificación botánica
Este trabajo fue desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular y en el Herbario de la Universidad Católica de Oriente (HUCO) durante el año 2014.
Se hicieron muestreos en 6 fincas productoras de crisantemo en el Oriente Antioqueño con la siguiente codificación: SV326, LC421, y LV521 ubicadas en el municipio de la Ceja a una altitud de 2.200 msnm, una precipitación anual de 2.300 mm y temperatura promedio de 17°C; LA303 ubicada en el municipio de Rionegro a una altitud de 2.080 msnm, con precipitación anual entre 1.800 y 2.500 mm y temperatura promedio de 18.5 °C ; MM317 ubicada en Marinilla a una altitud de 2.120 msnm, con precipitación anual entre 1.800 y 2.000 mm y temperatura promedio de 17°C; y la finca SA331 ubicada en la Unión a una altitud de 2.500 msnm, con precipitación anual de 2.500 a 3.000 mm y temperatura promedio de 16°C.
Las fincas para el muestreo de arvenses fueron elegidas de acuerdo a la incidencia que tuvieron de TSWV para el último año y a la disponibilidad para participar en el proyecto y permitir los muestreos. Se concertó una visita a cada finca y con la asesoría del gerente técnico se seleccionaron los tres invernaderos productivos que presentaron más alta incidencia de la enfermedad para la semana anterior al muestreo bajo el criterio “Número de tallos erradicados por virus”. Se realizó un muestreo al interior y al exterior del bloque, este último en un radio máximo de 2m  recorriendo todo el perímetro y muestreando siete puntos al azar, en el interior se colectó en forma de zigzag muestreando 13 puntos, cada punto muestreado equivale a una arvense colectada para un total de 20 muestras por bloque, 60 por finca. Cada muestra recolectada fue guardada en la bolsa exclusiva del invernadero en la cual se encontró y  debidamente rotulada con fecha de recolección, código de la finca, bloque, ubicación (exterior o interior). Todo el material colectado fue identificado en el herbario de la Universidad Católica de Oriente (HUCO), donde fueron incluidos 2 individuos por especie. Para la identificación del material fue utilizada la colección de referencia, así como claves taxonómicas, revisión de diferentes herbarios regionales (HUA, MEDEL y JAUM) y bases de datos especializadas (W3tropicos, IPNI).
Evaluación de la incidencia de TSWV en las arvenses colectadas
De las especies de plantas arvenses colectadas en cada finca, al regresar al laboratorio de Biología Molecular el mismo día de cada visita y antes de prensar las muestras,  se tomó parte del tejido foliar joven el cual se pesó y  se almacenó en papel aluminio a una temperatura constante de -20°C para evaluar la infección por TSWV usando una prueba DAS-ELISA comercial de Agdia (Elkhart, IN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada muestra fue diluida en relación peso: volumen, 1:5 con el buffer de extracción general incluido en el kit (GEB 1X).
Recolección e identificación de adultos de trips asociados a las arvenses
Para la colecta de trips en las 6 arvenses identificadas como las más frecuentemente encontradas se muestrearon 4 fincas del Oriente antioqueño identificadas con los códigos SV326, LC421, MM317 previamente descritas y una adicional, rotulada como FC309 ubicada en el municipio del Carmen de Viboral a una altitud de 2.150 msnm, una precipitación anual de 1.800 mm  y temperatura promedio de 18°C.
Se seleccionan junto con los gerentes técnicos los tres invernaderos que presentaron mayor incidencia de TSWV para la semana anterior a la visita. En cada bloque se tomaron ocho plantas arvenses de cada especie, cinco dentro y fuera fuera en un radio máximo de 2m, así mismo, fueron seleccionadas dentro de cada invernadero tres plantas de crisantemo cerca de tres puntos donde se colectó una arvense. Cada planta fue sacudida sobre una tabla blanca y observando con lupa 20X fueron capturados los trips adultos con una herramienta diseñada para esta labor, que consta de un frasco de plástico tipo citoquímico con un orificio a cada polo, en cada orificio se introdujo un trozo de manguera de nivel de aproximadamente 12 cm, uno de los orificios tenia además un trozo de tela tipo velo para que los trips se quedaran en el frasco y no pasaran a la siguiente manguera; posteriormente con la ayuda de un pincel 000 los insectos fueron introducidos en tubos eppendorf de 1,5 ml, para cada especie de planta arvense, que contenían 1500 μL de etanol al 75%. Cada tubo por arvense y crisantemo fue marcado con fecha, finca y especie y enviado al Laboratorio Nacional de Diagnóstico Fitosanitario del ICA Tulio Ospina en Medellín para la identificación de las especies de trips presentes en cada una de las arvenses.
Evaluación de la incidencia de TSWV en arvenses por RT-PCR
Las plantas que fueron evaluadas por RT-PCR se colectaron así: seis en la finca SV326, seis en la finca LC421, seis en la finca MM317y dos en la finca FC309. Del tercio superior de cada planta de tomó una hoja joven para hacer una prueba RT-PCR, para lo cual se pesaron 100mg da cada una, se envolvió el tejido pesado en papel aluminio, se rotuló  y se almacenó a una temperatura constante de -20°C hasta el día de su evaluación.
Para efectuar la prueba RT-PCR, en primer lugar se realizó una extracción de ARN total usando el RNeasy Plant Mini kit, Qiagen No. Cat. 74904, siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se realizó la transcripción reversa, usando la enzima SuperScript®III, Invitrogen No. Cat.18080-093, con 2µL de ARN y el cebador PDH006 (CCCAGAGCAATCAGTGCA)10 y siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consistió en 2 µL de cDNA, 2,5 µL de buffer PCR 10X (200 mM Tris-HCl, 500 mM KCl), 2 µL de MgCl2 (25 mM), 0,5 µL de mezcla de dNTPs (10 mM), 1,2 µL de cada cebador específico (10 µM), es decir el PDH006, descrito anteriormente yPR035 (GAATATATGACACCATTG)10, 0,2 µL de GoTaq®-DNA polimerasa (5 U/µL) No. Cat. M3001 de Promega y agua ultra pura de grado molecular hasta un volumen final de 25 µL. Las muestras fueron llevadas a un termociclador T-personal de la marca Biometra, allí se ejecutó un programa que consistió en la denaturación inicial a 95 ºC durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos de 95 ºC por 90 segundos (denaturación), 60ºC por 30 segundos (hibridación de los cebadores) y 72 ºC durante 30 segundos (extensión), por último se realizó un ciclo de extensión final de 5 minutos a 72 ºC. Al finalizar este procedimiento, se observó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, en buffer TBE 1X, con 10µL de cada amplificado mezclado con 2µL de EZ-Vision®, Amresco No. Cat. N313, a 80V por 40 minutos. El resultado fue visualizado en un transiluminador UV y el tamaño del fragmento esperado (514pb) fue corroborado comparando las bandas con el marcador de peso molecular 100bp DNA ladder de Invitrogen No. Cat. 15628-019.
RESULTADOS
Identificación taxonómica de especies arvenses en cultivos de crisantemo
Las fincas elegidas para el muestreo de las arvenses presentaron incidencias en el último año representadas en número de tallos erradicados por sospecha de TSWV entre 0 y 13% (Tabla 1). La finca que presentó la más alta incidencia fue MM317 con un 13% y las fincas SV326 y SY331 presentaron las menores, con incidencias de 0%.
Tabla 1. Incidencia en porcentaje de TSWV que presentó cada finca al momento del muestreo
Se identificaron 34 especies arvenses diferentes pertenecientes a 19 familias botánicas, de las cuales la familia Asteraceae presentó el mayor número de representantes, con 12 especies. De las arvenses colectadas 9 fueron accesiones nuevas para la colección del HUCO. 4 especies estaban presentes en todas las fincas visitadas: C. hirsuta, G. quadriradiata, P. nepalense y S. vulgaris (Tabla 2).  
*Especie reportada como susceptible a TSWV
Tabla 2. Listado de las especies de arvenses encontradas y asociadas a bloques de producción de crisantemo en las zonas de colección.
Las especies de arvenses encontradas con mayor frecuencia (>10 veces) fueron: Amaranthus viridis, Cardamine hirsuta, Galinsoga quadriradiata, Polygonum nepalense, Oxalis latifolia y Senecio vulgaris. De estas, C. hirsuta G. quadrirradiata constituyen el 50% de la población observada (Figura 1).
Figura 1. Frecuencia de observación de las especies de arvenses asociadas a los cultivos de crisantemo del Oriente antioqueño.
La finca con mayor diversidad de arvenses fue MM317 con 22 especies, seguida por SV326 con 16 especies y las de menor diversidad fueron SY331 y LV521 con 8 especies cada una (Figura 2). El promedio para el número de arvenses encontradas en las fincas fue 15 y la media fue de 10.
Es de anotar que 15 de las 34 especies (44%) se encontraron frecuentemente dentro de los bloques de producción, en este grupo se encuentran las seis especies más frecuentes, las 19 restantes fueron frecuentemente encontradas por fuera de los bloques de producción. (56%).  
Figura 2. Diversidad de especies arvenses en fincas productoras de Crisantemo.
Detección de TSWV en las especies arvenses
Esta evaluación se hizo dos veces, en primer lugar por ELISA en 145 plantas de las 34 especies y luego en un muestreo posterior donde se evaluaron por RT-PCR 20 plantas de las 6 especies más frecuentemente encontradas. De las 145 plantas evaluadas por ELISA solo una especie dio resultados positivos a la infección por TSWV, Portulaca oleraceae esta fue encontrada al interior de un invernadero de la finca MM317, siendo la finca con la incidencia de TSWV más alta (13%) y la mayor diversidad de especies arvenses. La planta manifestó estos síntomas: anillos concéntricos de color café vistos a contra luz y clorosis en algunas de sus hojas jóvenes. Ninguna de las plantas evaluadas por RT-PCR presentó resultados positivos para TSWV, tampoco un nuevo ejemplar de P. oleraceae que fue encontrada en la finca LC421, cabe anotar que ésta última fue encontrada fuera del bloque de producción. (Tabla 3).
Tabla 3. Resultado de la prueba RT-PCR para detección de TSWV en las 6 arvenses más frecuentes.
Identificación de especies de trips asociados a las arvenses
Para la identificación de especies de trips se extrajeron los individuos presentes en las especies G. quadriradiata, C. hirsuta,  A. viridis, O. latifolia, S. vulgaris, P. nepalense y algunos tallos de crisantemo en floración cercanos a las arvenses colectadas dentro del invernadero de 4 fincas. La clasificación taxonómica hecha por el ICA estableció que las especies de trips presentes fueron Frankliniella occidentalis, Frankliniella panamensis y algunos individuos machos a los que no se les pudo identificar la especie, dado que las claves taxonómicas y las diagnosis de géneros y especies del orden Thysanoptera están basadas principalmente en caracteres morfológicos de las hembras14.
La especie de trips más comúnmente encontrada fue F. occidentalis  con 84 ejemplares (89%), 70 de ellos presentes en Crisantemo, 7 en  A. viridis, 5 en G. quadriradiata, 4 en C. hirsuta y 3 en S. vulgaris.  Casi siempre se encontró un mayor número de adultos que de larvas, la excepción fue S. vulgaris donde se pudieron extraer 2 larvas y 1 adulto, sin embargo, el número de trips fue tan bajo en las especies arvenses, que esto no representa un resultado significativo (tabla 4).
Tabla 4. Especies de trips y número de ejemplares presentes en cada especie vegetal
En cuanto a F. panamensis solo se hallaron 5 individuos (11%), 4 adultos y 1 larva en las especies A. viridis, C. hirsuta, O. latifolia y crisantemo. La larva encontrada fue extraída de un tallo de crisantemo.  F. occidentalis y F. panamensis fueron encontradas simultáneamente en A. viridis, C. hirsuta y crisantemo, indicando que estas especies son hospedantes de ambas especies de trips (tabla 4).
DISCUSIÓN
De las seis especies más frecuentemente encontradas en este trabajo, todas han sido reportadas como hospedero de TSWV, excepto O. latifolia P. nepalense. Sin embargo, si se han reportado como hospedantes otras especies de Oxalis sp y Polygonum sp. como: O. coniculata y O. tetraphylla por Ochoa-Martinez et al, 1999 y O. acetosella por Groves et al. 2002. En el caso de Polygonum, varios han reportado dos especies de este género: P. pensylvanicum y P. persicaria 2, 11. Se hace necesaria la evaluación de la susceptibilidad de O.latifolia P. nepalense a TSWV, dada la frecuencia en que fueron encontradas (7% y 9,4% respectivamente).
La mayor diversidad de especies encontradas en el exterior de los invernaderos de producción se explica por las prácticas culturales de desmalezado que se acostumbran a hacer al interior de los invernaderos en los cultivos de crisantemo y a la dispersión por el viento de las semillas de las arvenses que se encuentran a campo abierto.
En este trabajo se ha encontrado una incidencia de TSWV en las arvenses asociadas a crisantemo de 0,6%. De manera similar, en dos evaluaciones de arvenses asociadas a cultivos se observó un nivel de incidencia del 2% en crisantemo15 y en lechuga, se observó 1,5% de incidencia 20. En otros cultivos, como tomate se ha observado un efecto contrario, ya que se pudo asociar la presencia de arvenses con las incidencias más altas de la enfermedad (20 a 53%) 9. Esta diferencia puede deberse a la preferencia que parece tener F. occidentallis por las plantas de crisantemo, ya que se observó en este trabajo que el 75% de la población se  encontró en esta especie y nunca se evidenciaron daños ocasionados por trips en las plantas arvenses. Además, la densidad de siembra es diferente y esto puede contribuir a una mayor probabilidad de transmisión desde las arvenses al cultivo. En el caso de tomate es aproximadamente 20.000 plantas por hectárea, mientras que en el crisantemo es 648.000 plantas por hectárea, lo que hace una relación de 1 a 32 3, 16
En este trabajo se encontraron dos especies de trips, F. occidentallis y F. panamensis, siendo el primero mucho más abundante. F. panamensis ha sido reportado en cultivos de crisantemo y también en lisianthus, clavel y cartucho en la Sabana de Bogotá4. Sin embargo, la primera vez que esta especie fue reportada en Colombia se encontró en flores de trigo y cebada, y posteriormente fue encontrada en flores de avena (Figueroa, 1977, ICA, 1976 y Gallego, 1979 citados por Cardenas y Corredor, 1993). A pesar de que F.panamensis es común en los cultivos de flores, no ha sido reportada como vector de ningún Tospovirus, de modo que se puede inferir en este trabajo que solo F. occidentallis podría estar contribuyendo a la transmisión de TSWV, ya que este insecto si ha sido reportado como vector y además se ha demostrado que es el más eficiente 13.
Cardenas y Corredor (1993) encontraron que la especie dominante en invervaderos de flores de la Sabana de Bogotá era F. occidentallis, aunque se destacaba la presencia en menor cantidad de otras especies, entre ellas F.panamensis. Estos mismos autores resaltan que esta última especie era encontrada con mayor frecuencia alrededor de los invernaderos. En este trabajo F. panamensis fue encontrada en crisantemo. O.latifolia y A. viridis, que representó el 5.3% de la población.
Se encontraron larvas de F. occidentallis en plantas de crisantemo, pero también en las arvenses S. vulgarisG .quadrirradiata y A.viridis, lo que indicaría que estas plantas son reservorios de estos trips. De estas especies, solamente A. viridis ha sido reportada como hospedante de F. occidentallis2. A nuestro conocimiento actual este es el primer reporte de S. vulgaris y G. quadrirradiata como hospedantes de esta especie. En contraste, otras especies de los géneros Galinsoga sp. y Senecio sp. como G. parviflora,  S. cineraria y S. vernalis si han sido reportadas como hospedantes 2, 8.
CONCLUSIONES
Se logró una mayor frecuencia de captura de trips en las plantas de crisantemo que en las arvenses aledañas, lo que sugiere una mayor preferencia del insecto por este primer hospedante y explicaría la baja transmisión de TSWV observada en las plantas arvenses; ya que a menor número de visitas del vector, menor transmisión del virus. De modo que en este trabajo rechazamos la hipótesis inicial de que las arvenses sirven de fuente de inoculo primario en las epidemias de TSWV en crisantemo.
Se sugiere continuar este trabajo evaluando la susceptibilidad a TSWV de las seis arvenses más frecuentemente encontradas en este trabajo. Así mismo, se hace necesario desarrollar un protocolo para el diagnóstico de TSWV en trips que permita la detección de insectos viruliferos, esto facilitará el monitoreo de las epidemias.
En este trabajo y en trabajos anteriores se ha encontrado la especie F. panamensis dentro de los invernaderos de crisantemo, sin embargo se desconoce su relación con TSWV, es por esto que se recomienda evaluar la adquisición y efectividad de la transmisión de Tospovirus (especialmente TSWV) por esta especie entre los crisantemos y las arvenses asociadas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer a la Dirección de Investigación y Desarrollo de la Universidad Católica de Oriente por la financiación de este proyecto y al Grupo de Investigación de Crisantemo- Dendranthema por el apoyo en su ejecución mediante el permiso para hacer los muestreos.
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Recibido: 6 abril 2017
Aprobado: 20 junio 2017
Elizabeth Castro1, Mario Quijano2, Nubia Velásquez3
   1 Facultad  de Ciencias Agropecuarias, Universidad Católica de Oriente.
Grupo de Investigación de Sanidad Vegetal, Universidad Católica de Oriente
 Grupo de estudios florísticos, Universidad Católica de Oriente
Correspondencia: Dirección: Sector 3, Cra.46 No.40B-50, Rionegro, Antioquia, Colombia
                            E-mail: nvelasquez@uco.edu.co

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