Vol 8 No 3 2023 – 17

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Aislamiento, caracterización cultural y morfológica de aislados monospóricos del agente causal del moho gris de la hoja de Solanum lycopersicum L. en la provincia de Tungurahua.

Isolation, cultural and morphological characterization of monosporic isolates of the causative agent of gray mold on the leaf of Solanum lycopersicum L. in the province of Tungurahua.
Michel Leiva-Mora 1*, Dayana Jacome2, Pedro Pablo Páez3, Edwin Pallo4, Rodrigo Núñez5
1 Laboratorio de Biotecnología. Departamento de Agronomía, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato.
2 Carrera de Agronomía. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Técnica de Ambato.
3 Carrera de Agronomía, Instituto Superior Tecnológico Ciudad de Valencia, Quevedo, Los Ríos, Ecuador.
4 Departamento de Agronomía, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Ambato.
5 Facultad de alimentos y Biotecnología, Universidad Técnica de Ambato.
*Correspondence: m.leiva@uta.edu.ec; Tel.: +593 0999937691.
Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.03.17
RESUMEN
Una de las enfermedades fúngicas más frecuentes en Ecuador, que afecta al cultivo de tomate es el moho gris de la hoja, causado por el hongo ascomiceto Passalora fulva (Cooke) U. Braun & Crous, cuyo estado anamorfo corresponde a Cladosporium fulvum. La investigación tuvo el propósito de obtener aislados monospóricos a partir de hojas de tomate con signos del moho gris y caracterizarlos cultural y morfológicamente. La investigación se realizó en la provincia de Tungurahua donde se tomaron muestras en ocho cantones. Se obtuvieron 80 aislados monospóricos de C. fulvum a partir de hojas de tomate afectadas por el moho gris. Los aislados del hongo mostraron colonias de color verde oliváceo en el anverso y negro en el reverso, elevación superficial, textura afelpada y forma irregular. La mayoría de los aislados presentaron presentó bordes lobulados. No se observó pigmentación ni líquido de transpiración en las colonias de los aislados. El crecimiento micelial fue registrado a los 7 y 14 días, con velocidades promedio de 0,93 mm.día-1 y 1,23 mm.día-1, respectivamente. El diámetro promedio de las hifas fue de 5,41 µm, mientras que los conidióforos tuvieron un tamaño promedio de 33,01 µm mientras que los conidios tuvieron 6 µm de largo y 5 µm de ancho. Estas características coinciden con las descripciones morfológicas informadas para la especie C. fulvum.
Palabras claves: caracterización cultural, Cladosporium fulvum, moho gris, morfología, tomate
 
ABSTRACT
 
Gray leaf mold, caused by the ascomycete fungus Passalora fulva (Cooke) U. Braun & Crous (anamorph: Cladosporium fulvum), is one of the most common fungal diseases affecting tomato cultivation in Ecuador. This study aimed to isolate monosporic cultures from tomato leaves exhibiting signs of gray leaf mold and characterize them culturally and morphologically. The investigation was conducted in the Tungurahua province, where samples were collected from eight municipalities. Eighty monosporic isolates of C. fulvum were obtained from leaves affected by gray mold. The fungal isolates exhibited olive-green colonies on the obverse and black on the reverse, with raised surfaces, felty texture, and irregular shape. The majority of isolates displayed lobed edges. No pigmentation or exudates were observed in the colonies. Mycelial growth was measured at 7 and 14 days, with average velocities of 0.93 mm/day and 1.23 mm/day, respectively. The average hyphal diameter was 5.41 µm, while conidiophores had an average size of 33.01 µm, and conidia measured 6 µm in length and 5 µm in width. These characteristics correspond to the reported morphological descriptions of C. fulvum.
Keywords: Cladosporium fulvum, cultural characterization, gray mold, tomato, morphology
 
INTRODUCCIÓN
 
A partir de la llegada de los españoles a América, comenzaron a cultivarse pequeñas extensiones de tomate en las regiones andinas de Sudamérica, especialmente en el área Mesoamericana. Aunque inicialmente carecía de importancia económica, el tomate experimentó un alto grado de domesticación, dando lugar a variedades con diferentes tamaños, formas y colores de frutos1. En la actualidad, el tomate es considerado uno de los productos agrícolas más comercializados a nivel nacional e internacional, con un consumo total de aproximadamente 211 millones de toneladas métricas y una generación de alrededor de 25 millones de dólares2.
En Ecuador la producción de tomate de riñón se lleva a cabo en todas las regiones debido a su adaptabilidad a diferentes tipos de suelo. Su cultivo supera las 1970 ha, con una producción total de 62675 t y un rendimiento anual promedio de 32 t.ha-1. Las provincias con mayor producción son Tungurahua, Pichincha y Santa Elena y a su vez las que poseen rendimientos superiores3.
En la provincia de Tungurahua, el tomate se ha convertido en un cultivo de importancia económica entre los productores. En la mayoría de los casos, se utiliza el sistema de producción bajo cubierta, lo cual ha mejorado los rendimientos y la calidad del producto4. Sin embargo, a lo largo del ciclo vegetativo del cultivo, se presentan desafíos debido a la presencia de numerosas plagas causadas por hongos, bacterias, virus, nematodos e insectos, lo que puede afectar la calidad y la productividad. El manejo de dichas plagas puede significar hasta un 20% de los gastos que se incurren en la producción, lo que afecta la rentabilidad de los productores5.
Sobre el cultivo de tomate inciden enfermedades fúngicas que pueden dañar todas las partes de la planta e incluso causar la muerte prematura. Algunas de las principales enfermedades fúngicas incluyen éstos son agentes causales, no enfermedades Fusarium oxysporum sensu (Smith & Swingle), Alternaria solani (Ellis & G. Martin) L.R. Jones & Grout, Rhizoctonia solani (J.G. Kühn 1858), Phytophthora infestans (Mont.de Bary 1876), Leveillula taurica (Lév. G. Arnaud 192), Passalora fulva (Cooke) U. Braun & Crous 20032.Una de las enfermedades fúngicas más frecuentes en el país, que afecta al cultivo de tomate es el moho gris de la hoja, causado por el hongo ascomiceto P. fulva, cuyo estado anamorfo corresponde a Cladosporium fulvum6.
Los principales síntomas de la enfermedad incluyen manchas amarillas en el haz de las hojas y crecimiento filamentoso cubierto de conidios de color pardo oliváceo en el envés, lo que resulta en daños en la superficie foliar y una disminución en la capacidad de realizar la fotosíntesis, lo que afecta la calidad y el rendimiento de los frutos6. Se ha planteado que el manejo de esta enfermedad se puede lograr mediante medidas agronómicas como una buena ventilación en los invernaderos, una correcta fertilización, un adecuado manejo de las condiciones de temperatura y humedad en el invernadero, evitar la presencia de agua en las hojas y mantener una densidad de siembra apropiada de acuerdo con las recomendaciones técnicas de las variedades7.
Con el fin de realizar la identificación molecular de C. fulvum, se requiere seguir una serie de pasos críticos que incluyen el aislamiento, manipulación y análisis del hongo. En primer lugar, se debe extraer el ADN a partir de una cepa pura e intacta del hongo. A continuación, se sigue un protocolo específico que, si se lleva a cabo con éxito, puede contribuir al desarrollo de sistemas de diagnóstico y control de esta enfermedad9. De ahí la importancia de obtener aislados monospóricos a partir de hojas de tomate con signos del moho gris y caracterizarlos cultural y morfológicamente para conformar una colección de cultivo. definir claramente el objetivo de la investigación
 
MATERIALES AND MÉTODOS
 
La investigación se realizó en la provincia de Tungurahua, se tomaron muestras de hojas con signos de moho gris en ocho cantones y posteriormente se trasladaron al Laboratorio de Microbiología vegetal de la Facultad Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Ambato. Las muestras de hojas de tomate con signos del moho gris fueron colectadas de 8 cantones de la provincia de Tungurahua y fueron trasladas al laboratorio de microbiología vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias donde por método de impresión de hojas en el medio de cultivo PDA conteniendo sulfato de gentamicina (100 mg/L) para la obtención de los aislados de C. fulvum.
Para la caracterización de las colonias de los aislados monospóricos se evaluaron los siguientes aspectos: color de la colonia (el color del anverso y reverso), pigmentación de las colonias, diámetro de las colonias, textura de las colonias, borde de las colonias, presencia o ausencia de líquido de transpiración, velocidad de crecimiento micelial (mm. día-1).
Para describir las características morfológicas de los aislados monospóricos de C. fulvum se determinaron las siguientes: diámetro promedio de las hifas (100 hifas al azar), longitud promedio de conidióforos (50 conidióforos al azar) y de conidios (100 conidios al azar).
 
Obtención de aislados monospóricos de C. fulvum a partir de hojas de tomate con signos del moho gris.
Se tomó un fragmento de micelio a partir de colonias puras de C. fulvum. El micelio fue transferido a un tubo de ensayo con 9 ml de agua estéril y se agitó durante 35 segundos, de este contenido se tomó 1 ml y se vertió en un segundo tubo de ensayo bajo las mismas condiciones. Todo el contenido de este segundo tubo de ensayo fue vertido en una caja Petri con PDA y se realizaron movimientos circulares de esta. Al finalizar, el contenido líquido sobrante de la caja Petri fue vertido a un vaso de precipitación. Se sellaron las cajas Petri y se colocaron en posición vertical para ser incubadas en incubadora (Gallenkamp) a 20°C durante 24 horas. Transcurrido el tiempo con la ayuda del microscopio se seleccionaron cinco conidios y se transfirieron a una nueva caja de Petri. Para obtener a los ocho días de incubación a 24°C, los aislados monospóricos.
 
Caracterización cultural de las colonias de los aislados monospóricos de C. fulvum en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA).
La caracterización cultural se realizó bajo caracteres morfológicos cualitativos y cuantitativos. Se observó el color tanto del anverso como del reverso de la colonia, la forma, textura y borde de esta. También se evaluó la presencia/ausencia de: pigmentación y de líquido de transpiración así como la elevación de la colonia.
 
Caracterización morfológica de los aislados monospóricos de C. fulvum mediante microcultivos y su observación bajo microscopio clínico.
Se esterilizaron los materiales y medios (cajas de Petri, portaobjetos, vidrio fusible, papel filtro). Se preparó el medio de cultivo (PDA, Difco®). En el contenedor se colocó en el fondo el papel filtro previamente humedecido y posteriormente se acomodó un vidrio fusible que sirvió como soporte para el portaobjetos. Luego se procedió a dispersar ¼ de medio de cultivo PDA en los portaobjetos. Se dejó reposar por unos minutos hasta que el medio de cultivo gelificó, para sembrar el hongo en el portaobjeto. Finalmente se observaron las estructuras fúngicas (hifas, conidióforos y conidios) con un microscopio óptico de luz transmitida marca Leica DM500.
 
RESULTADOS
 
Obtención de aislados monospóricos de C. fulvum a partir de hojas de tomate con signos del moho gris.
Se obtuvieron 10 aislados monospóricos de cada cantón (Tisaleo, Baños, Patate, Ambato, Cevallos, Píllaro, Mocha y Pelileo) acorde con lo mostrado en tabla 1 partir de las muestras tomadas. Estos constituyen la primera colección de 80 aislados de la provincia Tungurahua (Figura 1). Como se aprecia en la figura 1 las colonias presentaron un color verde-oliváceo en el anverso de las mismas, mientras que en el reverso de las mismas se observa el color negro (figura 2).
Figura 1. Color verde oliváceo y gris (A y B) en el anverso y color negro (C y D) en el reverso de las colonias de los aislados de C. fulvum
 

          
Figura 2. Crecimiento de colonias de C. fulvum a partir de un solo conidio germinado a los 7 días de crecidas a 20°C.
 
Descripción de las características de las colonias de los aislados monospóricos de C. fulvum en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA).
Todas las colonias de los aislados monospóricos de C. fulvum en medio de cultivo Agar Papa Dextrosa tuvieron un color verde oliváceo en el anverso y negro en el reverso. El 80 % de las colonias presentaron un verde lobulado y el 98,8 % tuvo una forma irregular y la totalidad tuvieron tuvo una elevación superficial y una textura afelpada. Ningún aislado pigmentó el medio de cultivo (PDA), ni tampoco se encontró líquido de transpiración (tabla 1).
Tabla 1. Caracterización cultural de los aislados de C. fulvum  
         
El crecimiento micelial hasta los 7 días tuvo un promedio de 0,93 mm.día-1 y hasta los 14 aumentó a una velocidad de 1,23 mm.día-1 (tabla 2).
 
Tabla 2. Crecimiento micelial de los aislados monospóricos de C. fulvum
Caracterización morfológica de los aislados monospóricos de C. fulvum mediante microcultivos y su observación bajo microscopio óptico de luz transmitida
Al caracterizar los aislados monospóricos desde el punto de vista morfológico se observó que los conidios tuvieron un largo que osciló entre 2 µm a 14 µm, con un promedio de 6,01 µm, mientras que el ancho varió de 2 µm a 7 µm, con un promedio de 2,88 µm. Las hifas se ubicaron en un rango de 2 µm a 17 µm con un promedio de 5,4 µm. Los conidióforos presentaron registros de 82,00 µm hasta 110 µm de longitud, con un promedio de 94,56 µm (tabla 3).
Tabla 3. Caracterización morfológica de C. fulvum utilizando microscopio óptico de luz transmitida eliminar revisr tbl.
 
DISCUSIÓN
 
Los aislados monospóricos de C. fulvum a partir de hojas de tomate con signos del moho gris presentaron un color gris-oliváceo. Estos resultados coinciden con los observados por Bernal8, quien informó la obtención de aislados de C. fulvum con colonias de tonalidad gris a gris oliváceo, textura suave y bordes irregulares, y el reverso de color negro. Según sus conclusiones, estas características morfológicas fueron homogéneas entre los aislados y no permiten establecer una relación patogénica específica. A su vez, nuestros resultados difieren de los obtenidos por Lucentini et al.6 quienes plantean que “a partir de hojas de tomate con síntomas y signos típicos del Moho de la hoja del tomate obtuvieron cultivos monospóricos con una coloración púrpura en el medio agar-agua 2%.
Medina9 afirmó que las características morfológicas y culturales de los aislados de C. fulvum son elementos necesarios para su clasificación. En este estudio, se obtuvieron resultados similares a los encontrados en la investigación mencionada anteriormente. Sin embargo, se observó que ciertos aislados presentaban un color verde oliváceo y bordes más regulares. Estos aislados se obtuvieron de lugares con condiciones controladas y considerando que las condiciones agrometeorológicas en las diferentes localidades de la provincia Tungurahua quizás haya sido el motivo de la uniformidad de las colonias observada. Además, el cultivo de tomate riñón bajo invernadero es común en todos los cantones estudiados donde suelen prevalecer las mismas variedades y técnicas de manejo. Estas circunstancias pudieron contribuir a que los aislados de C. fulvum obtenidos fueran uniformes.
Se describen diversas características de las colonias de aislados monospóricos de C. fulvum, como su color en el anverso y reverso, borde, pigmentación, líquidos de traspiración, elevación, textura y forma. Los resultados obtenidos demuestran una notable uniformidad en estos rasgos. Por otra parte es la primera vez que se obtienen aislados monospóricos de este hongo en Ecuador. Sin emabrago, Lucentini et al.6 sostuvieron que existe una considerable diversidad en la población de C. fulvum debido a cambios genéticos en su genoma lo cual no fue observado ni a nivel morfológico ni cultural en los aislados obtenidos. El presente estudio coincide con Bernal8, quien indicó que las características culturales de los aislados de C. fulvum suelen ser homogéneas. Además, Medina9 sugirió que el medio de cultivo utilizado influye en la obtención de colonias homogéneas, algo común con DPA pero no tan frecuente en otros medios de cultivo.
La producción de tomate bajo cubierta es muy frecuente en la provincia de Tungurahua, y la presencia de C. fulvum está ampliamente extendida en toda la provincia. Las condiciones controladas en los invernaderos, como la temperatura y humedad, limitan cualquier influencia de la ubicación y altitud en las características de las colonias obtenidas. Sin emabargo, tomando como punto de partida esta investigación, se recomienda realizar estudios más exhaustivos que involucren técnicas genéticas más resolutivas con las cuales se podrían determinar diferencias entre aislados que cultural y morfológicamente son similares.
Según la investigación realizada por Bernal et al.10, se encontró que el crecimiento micelial de C. fulvum es óptimo en el medio de cultivo PDA a una temperatura de 24°C, sin embargo en nuestros aislados fue favorable la temperatura de 20°C. Después de los 7 días de crecidas las colonias, la velocidad de crecimiento micelial variaron entre 0,65 mm.día-1 hasta 1,17 mm.día-1, de acuerdo con los resultados plasmados en la Tabla 2. Estos valores de crecimiento, observados en el mismo período de tiempo, estuvieron en el rango de 0,50 mm.día-1 a 1,29 mm.día-1, lo cual concuerda con los hallazgos de la investigación mencionada anteriormente.
Los resultados de la caracterización morfológica de los aislados monospóricos, presentados en la Tabla 3, revelan variaciones en el tamaño de los conidios. Se observó que el largo de los conidios osciló entre 2 µm y 14 µm, con un promedio de 6,01 µm, mientras que el ancho se encontró entre 2 µm y 7 µm, con un promedio de 2,88 µm. En el estudio realizado por Bernal8, se obtuvieron conidios de tamaños diversos, con medidas de 20,1 µm a 23,2 µm de largo y 4,6 µm a 5,81 µm de ancho, y presentaron colores verde y gris oliváceo. Lucentini et al.6 mencionaron que estos cultivos exhiben un alto índice de crecimiento y conidios relativamente pequeños. La localidad no parece tener un impacto significativo en las diferencias morfológicas de los hongos estudiados, ya que se observó una amplia variabilidad en todos los aislamientos sin distinguir una localidad o altitud en particular. El tamaño de los conidios está relacionado con la velocidad de crecimiento, indicando que a medida que el crecimiento es más lento, los conidios tienden a ser más grandes9.
En cuanto a las hifas, se encontraron en un rango de 2 µm a 17 µm, con un promedio de 5,4 µm. Según Knapp11, las dimensiones de las estructuras fúngicas microscópicas, como las hifas, están principalmente influenciadas por las condiciones fisicoquímicas del medio de cultivo. Aunque el medio PDA es propicio para el desarrollo de colonias fúngicas, se obtienen mejores resultados con otros medios como MEA (Agar-Extracto de Malta) o SNA (Agar-Nutritivo sintético) en términos del desarrollo de las hifas.
Por último, los conidióforos presentaron una variación en el tamaño, que varió desde 82 µm hasta 110 µm, con un promedio de 94,56 µm. Medina9 mencionó que los conidióforos de C. fulvum son casi erectos, ramificados y flocosos, a menudo forman un césped, con un color oliva, aunque las dimensiones registradas en su estudio fueron más alargados y más redondeados que los informados en el presente trabajo.
 
CONCLUSIONES
 
En esta investigación se obtuvieron 80 aislados monospóricos de C. fulvum a partir de hojas de tomate afectadas por el moho gris en diferentes eliminar!!! cantones de la provincia de Tungurahua. Los aislados del hongo mostraron características morfológicas consistentes, como colonias con color verde oliváceo en el anverso y negro en el reverso, elevación superficial, textura afelpada y forma irregular. La mayoría de los aislados presentaron presentó!!! bordes lobulados. No se observó pigmentación ni líquido de transpiración en las colonias de los aislados. El crecimiento micelial fue constatado a los 7 y 14 días, con velocidades promedio de 0,93 mm.día-1 y 1,23 mm.día-1, respectivamente. El diámetro promedio de las hifas fue de 5,41 µm, mientras que los conidióforos tuvieron un tamaño promedio de 33,01 µm y los conidios un tamaño promedio de 6 µm de largo y 5 µm de ancho. Estas características coinciden con las descripciones morfológicas conocidas de la especie C. fulvum.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, Michel Leiva Mora; Metodología, Michel Leiva Mora y Dayana Jacome; software, Michel Leiva Mora y Pedro Pablo Paez, validación, Michel Leiva Mora y Edwin Pallo, análisis formal, Michel Leiva Mora y Rodrigo Núñez; investigación, Michel Leiva Mora, Dayana Jacome, Pedro Pablo Paez y Rodrigo Núñez; recursos, Dayana Jácome y Michel Leiva Mora, curado de datos, Michel Leiva Mora y Rodrigo Núñez; redacción—redacción borrador original, Dayana Jácome y Michel Leiva Mora; redacción, revisión y edición, Michel Leiva Mora y Edwin Pallo; supervisión, Michel Leiva Mora; administración del proyecto, Dayana Jácome, adquisición del financiamiento, Dayana Jácome y Michel Leiva Mora; Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.
 
Agradecimientos: Agradecemos al apoyo ofrecido por la coordinadora de investigación Deysi Alexandra Guevara Freire y a las autoridades de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Técnica de Ambato, así como a la Dirección de Investigación y Desarrollo (DIDE-FCAGP) en particular a la doctora Lizette Leiva Suero por siempre haber valorado positivamente y apoyado los esfuerzos realizados en este proyecto, mismo que fue autofinanciado por la Seño-ita Andrea y el doctor Michel Leiva Mora.
Conflictos de interés: “Los autores declaran no tener conflicto de interés”.
 
REFERENCIAS
 
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Received: 28  May 2023/ Accepted: 15 July  2023 / Published:15 September 2023
Citation:  Leiva-Mora M , Jacome D, Páez P P, Pallo E, Núñez R. Aislamiento, caracterización cultural y morfológica de aislados monospóricos del agente causal del moho gris de la hoja de Solanum lycopersicum L. en la provincia de Tungurahua. Revis Bionatura 2023;8 (3) 17. http://dx.doi.org/10.21931/RB/2023.08.03.17

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