Palabras Clave: Bacteriocinas, Lactobacillus, Enterococcus, Patagonia

The antagonist activity of lactic acid bacteria (LAB) strains isolated from marine invertebrates of Chubut coast was studied.  Among the 92 isolates, 22 displayed activity: 3 strains were classified as Lactobacillus and 19 as Enterococcus. In all cases, after neutralization with NaOH and heat treatment the inhibitory activity of cell free supernatant of the strains studied remained active. Treatment with lysozyme and catalase did not affect the antimicrobial activity; however enzymatic activity of trypsin abolished the inhibitory action of the supernatants, confirming the proteinacious nature of the active compounds. The activities against Listeria innocua ATCC 33090 achieved by Enterococcus strains ranged between 640 and 163.840 arbitrary units/milliliter (AU/ml), while Lactobacillus strains displayed activities between 20 and 40 AU/ml. The strains E. mundtii 278Pe, E. hirae 463Me and E. hirae 471Me exhibited the highest inhibitory activities against a wide spectrum of pathogenic bacteria and/or food contaminants. In spite of extensive available information about these microorganisms, there are few studies of LAB from invertebrates of marine origin. The results obtained in this study suggest that this source may contribute to the finding of novel bacteriocin like substances with potential use in food industry.

Keywords: Bacteriocins, Lactobacillus, Enterococcus, Patagonia

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El medio marino es un reservorio excepcional, alberga una gran variedad de organismos con potencial para producir diversos productos naturales con propiedades bioactivas como antibacterianos, antifúngicos, antivirales, entre otros. En la actualidad, tanto el interés académico como industrial se concentra en microorganismos, en parte debido al creciente número de metabolitos biológicamente activos reportados en bacterias marinas, específicamente en bacterias ácido lácticas (BAL) ⁽¹⁾.

Las BAL constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos Gram positivos, que producen ácido láctico como principal metabolito durante el proceso de fermentación. No obstante, sus altos requerimientos nutricionales, se han adaptado para crecer en condiciones ambientales muy diferentes y están ampliamente extendidas en la naturaleza ⁽²⁾. Las BAL presentan gran potencial biotecnológico, son capaces de producir metabolitos con actividad antimicrobiana que exhiben mecanismos inespecíficos (diacetilo, ácidos orgánicos y peróxido de hidrógeno) o específicos como el caso de las bacteriocinas. Las bacteriocinas son moléculas antimicrobianas de naturaleza peptídica, con un origen genético diverso, suelen presentar modificaciones postraduccionales y pueden funcionar como una estrategia competitiva contra otros microorganismos ⁽³⁾.

El ambiente marino de la Argentina presenta una gran extensión, como así también una alta productividad biológica y biodiversidad de macro y microorganismos. A pesar de presentar un gran potencial para aplicaciones biotecnológicas, los microorganismos que habitan estos ecosistemas permanecen mayormente inexplorados y sus propiedades aún no explotadas ⁽⁴⁾.

En el presente trabajo se describe la capacidad inhibitoria de cepas de BAL productoras de sustancias antimicrobianas contra microorganismos Gram positivos y negativos, aisladas de invertebrados marinos de la provincia del Chubut (Patagonia-Argentina). Además, se describen las principales características fisicoquímicas de los metabolitos bioactivos.

Se tomaron muestras asépticamente del contenido intestinal de mejillón patagónico (Mytilus edulis platensis), caracol (Adelomelon ancilla), navaja (Solen tehuelchus), almeja rayada (Ameghinomya antiqua), vieira tehuelche (Aequipecten tehuelchus) y papa de mar (Polyclinidae) de las localidades de Puerto Lobos, Puerto Madryn, Playa Unión, Camarones, Comodoro Rivadavia y Rada Tilly, pertenecientes a la provincia del Chubut, Argentina. Las muestras se trasladaron a 4 º C hasta el laboratorio y se procesaron dentro de las 8 -10 h. El enriquecimiento primario se realizó en caldo de Man, Rogosa & Sharp (MRS), MRS ajustado a pH 4,6 y 5,4; MRS con NaCl al 8 %, caldo M17 y caldo de púrpura bromo-cresol azida. Los enriquecimientos se incubaron a 30 ºC durante 24-48 h. Luego del período de incubación los cultivos líquidos se repicaron a agar MRS respetando la misma composición que su respectivo medio de enriquecimiento, agar M17 y agar bilis-esculina. Todos los medios sólidos se suplementaron con ácido nalidíxico (20 μg/mL) y nistatina (10 μg/mL) y se incubaron durante 24-72 h a 30 ºC. Se realizaron repiques hasta obtener cultivos puros que se conservaron a -30 ºC en el Cepario del Laboratorio de Biotecnología Bacteriana como parte de la colección.

Las colonias sospechosas se sometieron a las siguientes pruebas bioquímicas: coloración de Gram, catalasa, oxidasa, fermentación de azúcares, producción de pigmento, crecimiento en NaCl (6,5 y 8 %), actividad de pirrolidonil aminopeptidasa y producción de gas (CO₂) a partir de glucosa.

Las cepas de BAL se cultivaron en caldo MRS a 30  ºC hasta alcanzar la fase estacionaria (12-16 h). Luego del período de incubación los medios se centrifugaron a 3.000 rpm durante 15 min. Los sobrenadantes libre de células (SLC) se emplearon en el ensayo antimicrobiano que se realizó por el método de difusión en placa según la metodología descrita por Vallejo y col. ⁽⁵⁾. Los microorganismos utilizados como indicadores se encuentran listados en la Tabla 1.

Los SLC de las cepas de BAL se trataron con NaOH 0,5 M hasta alcanzar la neutralidad. Los sobrenadantes neutralizados se sometieron posteriormente a una temperatura de 80 ºC (5 min) y 100 ºC durante 5, 15 y 30 min. La sensibilidad a enzimas se llevó a cabo, determinando la actividad residual luego de tratar los SLC durante 2 h con tripsina, lisozima y catalasa (5 mg/mL) en las condiciones óptimas para cada enzima. En todos los ensayos la actividad residual se determinó por el procedimiento previamente descrito.

La determinación cuantitativa de la actividad se realizó por el método de difusión en placa mediante la dilución seriada de los SLC según lo descrito anteriormente ⁽⁵⁾, utilizando como microorganismo indicador a Listeria innocua ATCC 33090. Los resultados se expresaron como unidades arbitrarias/ml. Las unidades arbitrarias (UA) equivalen a la inversa de la mayor dilución con actividad antimicrobiana (halo de inhibición), dividido por los mililitros de sobrenadante sembrados (UA=1/dilución/ml sembrados).

De las muestras procesadas de invertebrados marinos se lograron aislar y clasificar mediante identificación fenotípica 92 cepas de BAL pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Enterococcus. Del total de microorganismos aislados, 3 cepas correspondientes al género Lactobacillus sp. y 19 Enterococcus exhibieron actividad inhibitoria contra uno o más de los microorganismos utilizados como indicadores (Tabla 1). La mayor actividad se presentó contra cepas del género Listeria y otras BAL, mientras que no se obtuvo inhibición contra bacterias Gram negativas, salvo la especie de Vibrio anguilarum. Estos resultados son coincidentes con los obtenidos en trabajos previos con BAL provenientes del medio marino ^{(1, 6, 7, 8)}.

La distribución de especies de enterococos encontrada en este estudio es comparable con los resultados expuestos en trabajos previos en cepas de la región, en los cuales E. faecalis y E. faecium fueron las especies predominantes en alimentos y animales ⁽⁹⁾. En este trabajo, además de las especies antes mencionadas se aislaron cepas de E. hirae, E. mundtii  y E. columbae proveniente de mejillón patagónico, pepino de mar y navaja respectivamente.

En el presente estudio, la alta frecuencia de aislamientos de BAL sugiere que, no obstante los complejos requerimientos nutricionales exigidos por estos microorganismos, exhiben una alta adaptabilidad a un variado número de ambientes incluyendo, como en este caso, al medio marino. Estos resultados, como en anteriores realizados en peces de la costa noreste del Chubut ⁽⁵⁾ y del estuario de Bahía Blanca ⁽¹⁰⁾ confirman la presencia de BAL productoras de sustancias inhibitorias tipo bacteriocinas (SITB). Sin embargo, existen escasos reportes de BAL productoras de antimicrobianos provenientes de invertebrados marinos ⁽¹¹⁾, menos aún en la zona marítima patagónica, lo que resulta un nicho ecológico escasamente estudiado y con gran potencial biotecnológico.

Luego de tratar los SLC de las cepas seleccionadas con NaOH hasta alcanzar la neutralidad, el efecto inhibitorio no exhibió modificaciones. Los mismos resultados se obtuvieron cuando los sobrenadantes neutralizados se sometieron a los tratamientos térmicos. El tratamiento enzimático llevado a cabo con catalasa y lisozima no alteró la actividad antagonista ejercida por los sobrenadantes de las 22 cepas seleccionadas, en cambio el tratamiento con tripsina abolió por completo la capacidad inhibitoria. Estos resultados confirman que la actividad antimicrobiana del principio activo no es ejercida por el peróxido de hidrógeno, su naturaleza proteica y la ausencia de azúcares en su estructura, características compatibles con SITB. En todos los casos estudiados, la estabilidad térmica de estas moléculas indicaría que se trata de péptidos de bajo peso molecular con actividad antilisteria, propiedades que permiten incluirlas dentro del grupo de bacteriocinas clase I o II ⁽³⁾.

Los títulos de la actividad antagónica contra L. innocua ATCC 33090 resultaron variables. Las cepas de Enterococcus lograron actividades comprendidas entre 640-163.840 UA/ml, mientras que las 3 cepas de Lactobacillus presentaron títulos inferiores (20-40 UA/ml). Estos resultados, como en trabajos previos ^{(6, 8)} demuestran el potencial antimicrobiano de las cepas de enterococos, rasgo distintivo en este género de BAL. Las cepas de E. mundtii (278 Pe) y E. hirae (463 Me y 471 Me) exhibieron la mayor actividad antagónica, un espectro inhibitorio contra cepas patógenas y/o contaminantes de alimentos Gram positivas y negativas, resultados prometedores si tenemos en cuenta que las mencionadas especies son poco frecuente en este tipo de hábitat.

A diferencia de otras BAL, el género Enterococcus no es considerado un organismo GRAS (microorganismos reconocidos como seguros), aunque algunas especies se utilizan como probióticos para humanos y animales ⁽¹²⁾. En consecuencia, se hace indispensable completar los estudios de potenciales factores de virulencia y/o rasgos negativos en las cepas de enterococos bacteriocinogénicas para futuras aplicaciones en la biopreservación de alimentos.

La mayor parte de la investigación sobre BAL se ha direccionado a cepas de origen terrestre, específicamente relacionadas con la industria láctea y sus derivados. Sólo unos pocos estudios se han centrado en el aislamiento en este grupo bacteriano a partir de invertebrados marinos y en la búsqueda de su capacidad para producir bacteriocinas. Las cepas de BAL estudiadas en este trabajo, específicamente las especies de Enterococcus son productoras de SITB que podrían resultar efectivas para el control de biológico de bacterias patógenas como Listeria monocytogenes.

Los autores agradecen al Dr. José Francisco Fernández-Garayzábal y al Lic. Pablo Ledesma por suministrar las cepas indicadoras.  Este trabajo fue financiado con fondos otorgados por la Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco al proyecto “Potencial biotecnológico de enterococos aislados del medio marino patagónico”.

1.      Desriac F, Defer D, Bourgougnon N, Brillet B, Le Chevalier P & Fleury Y. Bacteriocin as weapons in the marine animal-associated bacteria warfare: inventory and potential applications as an aquaculture probiotic. Marine Drugs. 2010; 8: 1153-1177.