Vol 1 No 3 2016 – 8

ARTÍCULO DE REVISIÓN

**Banco de recursos genéticos de Auricularia spp. con fines industriales**

Bank of genetic resources Auricularia spp. for industrial purposes

Available from: http://dx.doi.org/10.21931/RB/2016.01.03.8

Edwin Ortiz¹, Claudia Soto Arroyave², Carlos Saransi¹, Klever Ayala¹, Lucia Faz¹, Napoleón Benavides¹, Pablo Vela¹, Patricia Rosero¹, William Gómez¹, José Huaca Pinchao¹, Homero Vaca Vasquez³, Rubén Darío Guzmán Torres⁴, Guillermo Parrado Castro⁵, Stefanía Duarte Trujillo⁵, Alejandro Pineda Soto⁶, Alexandra Elizabeth Jácome Ortega¹, Jorge Caraguay¹.

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RESUMEN

La Auricularia spp. presenta amplio potencial industrial debido a sus propiedades nutricionales y medicinales. La obtención de cepas viables y puras de este género se ha visto limitada por una identificación de especies meramente macroscópica y la utilización tanto de medios como técnicas de conservación inadecuados. El objetivo de esta revisión fue describir el proceso de obtención de cepas puras y viables del género Auricularia spp. a partir del medio natural, para resaltar datos técnicos, que faciliten la conformación de bancos de recursos genéticos fúngicos. Estos fungarios constituyen una alternativa para la preservación la biodiversidad fúngica del Ecuador y la obtención de cepas puras y viables. Lo anterior se logra con buenas prácticas de identificación tanto fenotípica como genotípica, de aislamiento en medio selectivos para evitar la inhibición competitiva por otros microorganismos, de conservación y de almacenamiento de especies por congelación, liofilización, repique o inmersión en líquidos inertes como agua o aceite mineral.

Palabras clave: Auricularia spp., recursos genéticos, biodiversidad fúngica, aprovechamiento industrial.

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ABSTRACT

Auricularia spp has broad industrial potential due to its nutritional and medicinal properties. Obtaining viable and pure strains of this genus has been seen limited by a merely macroscopic identification of species and the utilization of both inadequate mediums and inadequate conservation techniques. The objective of this review was to describe the process of obtaining pure and viable strains of the genus Auricularia spp. from the natural environment, to highlight technical data that facilitate the establishment of banks of fungal genetic resources. These fungarios are an alternative for preserving the fungal biodiversity of Ecuador and obtaining pure and viable strains. This is achieved with good practices of phenotypic and genotypic identification, isolation on selective medium to avoid competitive inhibition by other microorganisms, conservation and storage of species by freezing, lyophilization, peal or immersion in inert liquids such as water or oil mineral.

Keywords: Auricularia spp., genetic resources, biodiversity fungal, industrial use.

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INTRODUCCIÓN

Se estima que existen en la naturaleza más de 1,5 millones de especies de hongos, de las cuales sólo se han descrito alrededor de 69 000 ¹. Tan sólo en el Ecuador se han estimado más de 100 000 especies de hongos ² y descrito tan solo 5 000 ³. Sin embargo, no se posee ningún registro oficial acerca de la cantidad de hongos que se encuentran en el territorio nacional; aunque existen colecciones útiles para la obtención de cepas fúngicas con propósitos académicos ⁴. Una de las más importantes es el Fungario de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador (PUCE) ⁵, el cual cuenta con más de 6 000 ejemplares, que fueron catalogados mediante la realización de proyectos de cooperación internacional ⁶.

Los bancos de recursos genéticos permiten identificar y conservar las especies fúngicas para su posterior estudio y uso, convirtiéndose además, en fuentes confiables para la obtención de cepas fúngicas puras genéticamente estables necesarias para la puesta en marcha de procesos productivos eficientes ⁷^,^8,9. El aprovechamiento de hongos filamentosos en los sectores alimenticio, cosmetológico y farmacéutico ha impulsado la formación de bancos de recursos genético con especies fúngicas de interés ¹⁰.

Estudios realizados a diversas especies del género Auricularia spp. han demostrado su potencial para la producción de biomasa y metabolitos secundarios, sin embargo, se desconoce el proceso a seguir para la conservación de cepas de interés, lo que conlleva a limitaciones tecnológicas en la identificación de las especies a nivel tanto fenotípico como genotípico, y en la selección de medio apropiados para el aislamiento ¹¹^, ¹².

El objetivo de esta revisión es describir el proceso de obtención de cepas del género Auricularia spp. a partir del medio natural, para resaltar datos técnicos, que por desconocimiento y no aplicación han obstaculizado la obtención de cepas puras y viables con fines tanto industriales como académicos.

HONGO OREJA DE PALO (AURICULARIA SPP.)

Auricularia spp. es una seta producida a escala industrial, perteneciente a la familia Auriculariaceae, ampliamente conocida como hongo oreja u oreja gelatinosa de palo. Se han descrito alrededor de quince especies ^13–15; entre ellas se encuentran: A. auricula, A. polytricha, A. delicata, A. mesentérica, A. cornea, A. peltata, A. fuscosuccinea, y A. auricula-judae; siendo las dos primeras las más producidas y estudiadas a nivel mundial ¹⁶. Crece de forma natural en los tallos y las raíces de algunos árboles, así como en materiales de madera en descomposición ^14,15, lo que se debe al sistema enzimático que tiene para degradarle; principalmente celulasas, hemicelulasas y ligninasas ^17,18. La Auricularia spp puede crecer sobre la madera húmeda (Fig. 1).

Según Chang y Miles ¹⁹, este hongo fue el primero en cultivarse a nivel mundial, en China, hace 2 600 años. Actualmente, es el cuarto hongo más consumido a nivel mundial después de Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus y Lentinula edodes ²⁰. Su producción a escala industrial representa una excelente alternativa para el reciclaje de residuos agroindustriales y la generación de proteína unicelular. Este hongo presenta una larga vida de anaquel ²¹, aunque su palatabilidad se ha visto limitada por su textura correosa ¹⁵.

La Fermentación en Estado Sólido (FES) es uno de los métodos más empleados para la producción industrial de esta especie fúngica, en la cual se utiliza una amplia gama de sustratos lignocelulósicos como fuente de nutrientes y medio para su desarrollo ²², destacándose el aserrín de madera, cascarilla de arroz, tusa, bagazo de caña, paja de trigo y paja de sorgo ²³. Residuos menos convencionales como pulpa de café ²⁴, residuos del prensado de la oliva ²⁵, hojas de plátano, fibra de coco, cáscaras de cacao ²⁶, hojas y raquis de palma de aceite ²⁷ y demás residuos de poscosecha ²⁸ también han mostrado ser aptos para la producción de Auricularia spp. Otros autores han mezclado diferentes sustratos lignocelulósicos para formular medios que cumplan los requerimientos nutricionales del hongo y aumenten sus rendimientos ^27,29. También se reporta la adición de suplementos orgánicos al medio con el fin de compensar la escasez de minerales y vitaminas, necesarios para la obtención de altos rendimientos de producción ^30,31.

Recolección

Se identifican macroscópicamente los cuerpos fructíferos. Entre las principales características a evaluar, se encuentran el color, la textura, y el tamaño de las colonias. Las especies del género Auricularia spp. se caracterizan por poseer cuerpos fructíferos cerosos (Fig. 2) y cartilaginoso que varían el color marrón a negro violáceo ³². Por tanto, es fácil reconocer los hongos que pertenecen a este género; sin embargo, la identificación a nivel de especie es una tarea difícil, dada la gran diversidad morfológica que poseen los distintos cuerpos fructíferos ³³ (Fig. 3).

Aislamiento

Los hongos se aíslan del medio natural con el fin de obtener cepas puras para emplearlas como semilla o inóculo sobre el sustrato ²⁶. El aislamiento de la cepa puede hacerse a partir de las esporas del cuerpo fructífero o de la carne del mismo (micelio anastomosado) ¹⁵. El empleo del micelio inóculo presenta ventajas frente a las esporas ya que las hifas no requieren de una compatibilidad sexual para fructificar, como es el caso de las esporas³⁴.

El uso de medios selectivos para el desarrollo de distintos hongos es una técnica que favorece crecimiento de cultivos axénicos. La acidificación del medio de cultivo es una estrategia para la inhibición de bacterias, gracias a que la mayoría de especies como Auricularia se desarrollan en un pH ácido; además, la adición de antibióticos garantiza la inhibición de dichos contaminantes microbianos ³⁵. Según Quimio³⁶ los medios de cultivo más eficientes para el aislamiento de especies del género Auricularia spp., en orden descendente son: glucosa-extracto de levadura, extracto de malta y extracto de papa. Una vez aislado el hongo en cajas de Petri o tubos de ensayo (Fig. 4), debe mantenerse en refrigeración y repicarse periódicamente para evitar el envejecimiento de la cepa ¹⁵. Es necesario contar con una cámara de flujo laminar para favorecer la axenia de los cultivos; el empleo de mecheros de bunsen no es muy efectivo.

Identificación

Se basa principalmente en la identificación de las características microscópicas del hongo mediante observación tanto del micelio como de sus estructuras reproductivas utilizando lactofenol o azul de algodón como reveladores de microscopía (Fig. 5). Las características tanto macroscópicas como microscópicas son comparadas con las claves taxonómicas existentes en la literatura, con el fin de clasificar la especie fúngica ³³. Actualmente, existe una base de datos con claves taxonómicas denominada FUNGIPEDIA³⁷, disponible gratuitamente en la web.

Kobayashi ¹¹ propuso como base para la identificación de las distintas especies de este género las características morfológicas de los cuerpos fructíferos, la estructura del tejido, los filamentos en la superficie superior, el color del himenóforo, la zona pilosa y el tamaño de la capa medular. Una de las formas para diferenciar algunas de las especies del género Auricularia según Lowy ³⁸,se basa en la existencia o carencia de una capa medular intermedia en las hifas. Especies como A. córnea, A. fuscosuccinea, A. tenuis, A. emini y A. polytricha poseen capa medular, mientras que especies como A. auricula-judae, A. delicata, A. mesentérica, A. ornata, y A. peltata no poseen esta estructura ¹². No obstante, todas las características físicas mencionadas pueden verse afectadas por las condiciones de cultivo, como la temperatura, la humedad, la luz y la ubicación de la seta sobre el sustrato ¹¹.

Actualmente, la identificación de especies o cepas fúngicas puede realizarse mediante estudios filogenéticos moleculares que secuencian el ADN nuclear presente en las estructuras fúngicas, lo que permite establecer grados de emparentamiento entre hongos e identificar infinidad de especies con una mayor exactitud ¹². La amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD, por sus siglas en inglés), es una tecnología filogénica que ha sido empleada para la diferenciación de cepas individuales de A. auricula y A. polytricha, que no pueden ser discriminadas por polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés)²⁰.

Caracterización fisicoquímica

Nutricionalmente, Auricularia spp. contiene altos niveles de proteína (aproximadamente el 30 % en base seca) y de elementos esenciales como vitaminas, minerales (Ca, P, Fe), y polisacáridos ²³. Según Stamets³⁹ la composición nutricional de A. auricula en base seca es: 8-10 % de proteína; 0,8-1,2 % de grasa; 84-87 % de carbohidratos; 9-14 % de fibra y 4-7 % de cenizas. Teniendo en cuenta que su contenido de agua es de aproximadamente el 90 %. El cuerpo fructífero de A. auricula es rico en hetero-polisacáridos, que están conformados por una cadena principal de residuos de D -glucosa con varias cadenas laterales de residuos β-1,3 como manosa, glucosa, xilosa y ácido glucurónico ⁴⁰. Adicional a sus propiedades nutricionales, cuenta con propiedades medicinales debido a que esta especie posee una gran gama de compuestos bioactivos favorables para la salud, lo que le convierte en un alimento nutracéutico o funcional de alta calidad. En la tabla se resumen las principales bioactividades de Auricularia spp.

Las propiedades medicinales de Auricularia spp. otorgan aplicaciones terapéuticas potenciales a sus compuestos bioactivos. Los polisacáridos de Auricularia aurea con carga negativa han sido empleados para formar polielectrolitos catiónicos en medio ácido de bajo peso molecular tras unión con quitosano, con el fin de servir como biopelícula y vehículo para fármacos proteicos hacia el intestino, donde se biodegrada y los libera ⁴¹. La melanina se aplica industrialmente como pigmento natural, antioxidante y agente antibacterial en los sectores alimenticio, cosmetológico, farmacológico, entre otros ⁴². Así mismo, los polisacáridos de A. auricula han sido empleados por su actividad antioxidante como conservantes de enlatados, principalmente escabeche ⁴³ y como suplementos de la harina de trigo para la elaboración de panes enriquecidos ⁴⁴.

Conservación y almacenamiento de cepas puras

El mantenimiento y la preservación de especies fúngicas asegura la estabilidad genética de las cepas y sus particularidades fenotípicas. La elección del método adecuado dependerá del tipo de hongo a preservar, la cantidad de especies o cepas, la finalidad del espécimen y los recursos humanos y financieros disponibles ⁴⁵. Adicionalmente, se requiere de unas instalaciones adecuadas que garanticen la asepxia. Algunos de los métodos para la conservación y almacenamiento de cepas fúngicas son:

Transferencia periódica: Este método consiste en repicar periódicamente el microorganismo en un medio de cultivo fresco cada vez que el organismos consuma los nutrientes del cultivo predecesor, brindándole las condiciones óptimas para su desarrollo ⁴⁶. Este método es poco recomendable ya que las células se siguen multiplicando obteniendo como resultado descendientes lejanos de las células iniciales, lo que puede ocasionar la pérdida de características propias del hongo y la modificación de su información genética consecuencia de la alternancia generacional ⁴⁵.

Liofilización: La liofilización se basa en la restricción de la actividad metabólica causada por la eliminación de agua del tejido fúngico almacenado, a través de un proceso de congelación y sublimación. Este proceso al igual que el de congelación requiere el uso de sustancias criopreservantes, pero de menor punto de evaporación en el que se suspende el material a liofilizar ⁴⁷. Una de las ventajas de la aplicación de este método es que permite almacenar los liófilos a temperatura ambiente, facilitando las labores de envió de cepas y disminuyendo costos causados por el uso de sistemas de refrigeración ⁴⁸.

Congelación: La congelación o criopreservación es un método ampliamente utilizado actualmente para la conservación de hongos ^47,49. Este consiste en almacenar el tejido fúngico en suspensión en un agente crioprotector líquido a temperaturas menores a cero grados centígrados, congelando el agua en el tejido, lo que limita la disponibilidad de agua líquida para las células, disminuyendo además las funciones metabólicas de las mismas. Es importante tener en cuenta el uso de sustancias criopresenvantes como el glicerol para evitar una posible lisis celular causada por la formación de cristales de hielo en el interior de la célula, además este método requiere del uso especial de equipos que mantengan la temperatura de almacenamiento para evitar la reactivación de las células, por tanto demanda un mayor consumo energético ocasionando un incremento en los costos ⁵⁰.

Inmersión en aceite mineral: Este método consiste en almacenar trozos de hongos desarrollados, en tubos de ensayo que contienen agar distribuido en la superficie interna del mismo, el cual posteriormente se recubre con una capa de aceite mineral estéril ^51,52. A través de la conservación de cepas por este método se reportan tiempos de almacenamiento de hongos filamentosos que van de los 3 a los 47 años, logrando un gran porcentaje de material puro y viable ⁵³.

Inmersión en agua destilada estéril: El método de preservación en agua destilada estéril es reconocido por ser un método sencillo y económico, que asegura la preservación exitosa de cultivos fúngicos por tiempo prolongado sin que disminuya la viabilidad de las cepas. Consiste en seleccionar muestras de tejido desarrollado (esporas o hifas) depositándolas en recipientes con agua destilada estéril para ser almacenados ^53–55

Banco de recursos genéticos

El Plan de Acción Mundial (PAM) para la Conservación y la Utilización Sostenible de los Recursos Fitogenéticos para la Agricultura y la Alimentación (RFAA), propuesto en la Cuarta Conferencia Técnica Internacional sobre RFAA (1996) y adoptado por más de 150 países incluyendo a Ecuador, establece como objetivo aumentar la seguridad alimentaria mundial mediante la conservación y la utilización sostenible de los recursos fitogenéticos ⁵⁶. Este plan prioriza la conservación de la diversidad genética de los recursos que permitan afrontar la crisis alimentaria, mediante la utilización de técnicas de conservación in situ y ex situ del genoma de especies con potencial genético para la producción sostenible. El Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos (DENAREF) lidera el Banco Nacional de Germoplasma del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) del Ecuador, la cual es la institución pública más relevante en cuanto al número de especies almacenadas en bancos de germoplasma se refiere en el país; sin embargo, esta colección no incluye al reino fungi ^57,58.

Por su parte, el Fungario QCA (M) de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la PUCE ⁵ cuenta con más de 6 000 ejemplares representados en al menos 40 órdenes y 112 familias, provenientes de 19 provincias; siendo considerada la colección más grande de este tipo en el país. Ha logrado aumentar significativamente su número de especímenes gracias a dos cooperaciones internacionales: Con la British Mycological Society en 1993 y la Universidad de Copenhauge durante los años 2002 a 2004. El fungario tiene un proyecto estudiantil de acción social en la Reserva orquideológica El Pahuma, donde se han identificado y recolectado varias especies de hongos, entre las que se encuentra Auricularia spp.

El éxito para el establecimiento de un banco de recursos genéticos de cualquier cepa fúngica se basa en la conservación de la pureza, preservación de la viabilidad y la estabilidad genética de los tejidos almacenados ⁴⁵.

Selección de cepas de interés

La selección de determinadas cepas fúngicas para la producción de biomasa se realiza a través de una serie de análisis o ensayos que relacionen los aspectos de mayor relevancia para su producción industrial en pro de la obtención de características de interés. Pruebas de crecimiento micelial ^59,60, evaluación de la aparición de primodios, características morfológicas de las carpóforos, tasas de bioconversión ³¹, propiedades organolépticas de la seta ⁶¹ e índices de rendimiento ²⁸ son algunos de los aspectos a tener en cuenta. Una vez establecida la cepa se procede a realizar labores de aislamiento e identificación que ratifiquen la correcta escogencia del material fúngico a reproducir. Ensayos de reproductibilidad en placas de Petri y la realización de cultivos a pequeña escala son métodos de selección que permiten evidenciar los factores anteriormente mencionados.

Conclusiones

Los bancos de recursos genéticos fúngicos o fungarios son una alternativa para preservar la biodiversidad de hongos del Ecuador; constituyéndose como un soporte para la realización de estudios de biología molecular y aplicaciones industriales. El éxito para el establecimiento de un banco de recursos genéticos de Auricularia spp. se basa en la conservación de la pureza, preservación de la viabilidad y la estabilidad genética de los tejidos almacenados. Lo anterior se logra con buenas prácticas de identificación tanto fenotípica como genotípica, de aislamiento en medio selectivos para evitar la inhibición competitiva por otros microorganismos, de conservación y de almacenamiento de especies por congelación, liofilización, repique o inmersión en líquidos inertes como agua o aceite mineral.

Agradecimientos

El proyecto de investigación que abarca esta publicación ha contado con la cooperación del Ingenio Azucarero del Norte (IAN) y del Centro Ecuatoriano de Biotecnología y Ambiente (CEBA).

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Recibido: 20 de abril de 2016.
Aprobado: 2 de junio de 2016.

¹Universidad Técnica del Norte (UTN), Ibarra. Ecuador.

²Universidad Católica de Oriente (UCO), Rionegro, Antioquia, Colombia.

³Centro Ecuatoriano de Biotecnología y Ambiente (CEBA), Ibarra. Ecuador

⁴Ingenio Azucarero del Norte (IANCEM), Ibarra. Ecuador.

⁵ Universidad de los Llanos (UNILLANOS), Villavicencio, Colombia.

⁶Escuela Politécnica Nacional (EPN), Quito, Ecuador.

Correspondencia: jpineda@utn.edu.ec

Vol 1 No 3 2016 – 8

**Banco de recursos genéticos de Auricularia spp. con fines industriales**

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